重度のMICを引き起こすマクロファウリング/スチール界面における栄養微生物群集と低酸素微生物群集に関するメタゲノム的洞察

npj 材料劣化編 7 巻、記事番号: 41 (2023) この記事を引用

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海洋環境における付着したマクロ付着物は鋼表面の複雑な腐食を引き起こし、その結果、カキと鋼の界面で局所的な腐食が発生し、ホヤと鋼の界面で均一な腐食が発生しました。硫酸塩還元細菌 (SRB) は、マクロ汚れで覆われた界面における微生物影響腐食 (MIC) プロセスに関与していると考えられています。 MIC プロセスにおける重要なメディエーターとしての海洋バイオフィルムの役割をより深く理解するために、メタゲノム技術を使用して微生物群集とマクロファウリングの被覆に対するそれらの反応を研究しました。ホヤと比較して、カキと鋼の界面に形成された局所的な嫌気性ゾーンは SRB の成長を刺激し、より高い FeS 含有量と深刻な局所的な腐食を引き起こしました。 SRB Desulfovibrio および Desulfobulbus と、SRB 関連機能遺伝子 dsr が増加する一方で、酸素関連機能遺伝子 coxC、ccoN、ccoO、ccoP、および ccoQ が減少することが判明しました。対照的に、マクロ汚損被覆のない鋼表面は微生物群集が最も豊富であるにもかかわらず、MIC の深刻度は低く、微生物の存在量/多様性と鋼の腐食促進との間に直接の関係がないことを示唆しています。

海洋付着生物とは、海洋施設の表面に付着する動植物や微生物の総称です。体の大きさに基づいて、微小付着生物（ミクロンスケール）とマクロ付着生物（センチメートルスケール）に分類されます1、2、3。汚損生物は、船舶、橋、石油プラットフォーム、パイプラインなどの海洋インフラに悪影響を与える可能性があります3、4、5、6。現在、生物付着と金属海洋腐食との関係に関しては、主に 2 つの研究方向があります。

まず、金属の海洋腐食に対する微生物の影響を研究します。微生物は金属の錆びのプロセスに大きく寄与していると考えられています。バイオフィルムを形成する微生物は、金属表面に急速に定着して、MIC を促進または阻害する可能性がある非常に複雑で動的な 3 次元 (3D) 構造を形成します 7,8。現在、海洋腐食性微生物の研究は、模擬現場環境または制御された実験条件下での金属腐食に対する混合または単一コロニーの影響を研究するために、主に実験室で培養可能な細菌に焦点を当てています9、10、11。かなりの数の論文が、硫酸塩還元細菌 (SRB)12、13、14、15、硝酸塩還元細菌 (NRB)16、17、18、酸生成細菌 (APB)19、および鉄バクテリアの影響を調査しています。 (IB) 海洋環境における金属腐食に関する 20,21。酸素欠乏条件下では、SRB が MIC14 の主な原因であると一般に考えられており、硫酸塩を末端電子受容体として使用して有機化合物を分解し、腐食性硫化物の生成を引き起こす可能性があります 12、13、14、15。 Gu ら 22,23 は、嫌気性 MIC 攻撃を 2 つの異なるタイプに分類しました。微生物の呼吸によって引き起こされる細胞外電子伝達 MIC (EET-MIC) と、腐食性代謝物の分泌によって引き起こされる代謝物 MIC (M-MIC) です。最近、MIC のメカニズムに関する研究がますます深まっています。 Zhouら24は、魅力的なモデル微生物であるShewanella oneidensis MR-1が、好気的条件下で鉄含有金属から電子を直接消費できることを発見した。この発見は、腐食が金属と微生物間の直接電子伝達の重要な経路を通じて発生する可能性があることを示しています。電子シャトルとしてのフラビンまたは H2 を介した嫌気性腐食、および FeO からの直接電子取り込みはすべて、S. oneidensis および関連種による潜在的な腐食メカニズムとして提案されています 25、26、27、28。 Tang et al.28 は、他の微生物や電極から電子を直接受け取ることが知られている電気泳動体である Geobacter sulfurreducens および Geobacter metallireducens による鉄から微生物への直接電子移動を介してステンレス鋼が腐食することを発見しました。別の代表的な海洋電気活性細菌である緑膿菌は、海洋生息地でバイオフィルムを形成する能力のある蔓延細菌であり、細胞外電子伝達 (EET) を介して炭素鋼に重篤な MIC を引き起こすことが確認されています 29,30,31。 Zhou ら 31 は、海水中でのステンレス鋼の生物腐食が、緑膿菌の phzH 遺伝子をコードする細胞外電子伝達を介して加速されることを発見しました。しかし、環境中には 105 ～ 106 種の微生物が存在するため、単一の微生物を研究するのには限界があります。したがって、腐食性の海洋環境における微生物群集の分析は、海洋 MIC の研究にも大きく貢献します 32,33。ハイスループットのシーケンス技術は良いアイデアを提供します。ハイスループットシークエンシングは、従来のサンガー（ジデオキシ）シークエンシングとは異なり、一度に多数の核酸分子を並行してシーケンシングできる技術です34、35、36、37、38。通常、1 回の配列決定反応で 100 Mb 以上の配列データが生成されます。 Procopio et al.38は、メタゲノミクス、メタトランスクリプトーム、メタボロミクスなどの方法論を環境サンプルからの配列データと組み合わせると、腐食性微生物バイオフィルムの役割の理解に新たな地平を開くだろうと提案した。ハイスループット DNA シーケンス技術の出現により、合金の腐食プロセスに直接的および間接的に関与する微生物種の同定が容易になりました 38。 Huttunen-Saarivirta ら 35 は、ハイスループットシーケンス (HTP シーケンス) を使用して、汽水における腐食挙動と生物付着傾向におけるステンレス鋼グレード間の相違点を明らかにしました。 Zhang et al.32 は、ハイスループットシーケンスを利用して、海水に 30 か月浸漬した後の金属表面の錆層内の微生物群集を調査しました。彼らは、炭素鋼、銅合金、アルミニウム合金などの各金属合金が、異なる微生物群集の発達につながるだろうと提案しました。さらに、炭素鋼の内側、中間、外側の錆層には、腐食に関連するさまざまな微生物群集が形成されました。

第二に、金属腐食に対する海洋マクロ付着生物の影響を研究します。マクロファウリングは、石灰質の貝殻の有無に基づいて、ソフトファウリング（非石灰質藻類、海綿動物、ホヤなど）とハードファウリング（フジツボ、カキなど）に分類できます3,39。マクロファウリングの付着は、海洋構造物の完全性と性能に重大な損傷を与える可能性があることが観察されています6、40、41。例えば、カキやフジツボなどの石灰質の貝殻の大きな付着は、海洋施設の局所的な深刻な腐食を引き起こす可能性があります40。この現象の最も一般的な説明は、マクロ汚れの付着によって鋼の表面に「生物学的閉じ込め層」が形成されるというものです。層の内部は酸素欠乏環境になりますが、層の外側には十分な酸素があります。酸素濃度セルの形成により、マクロ付着物と鋼との界面での隙間腐食が促進されます3。

しかし、マクロファウリングと鉄鋼の間の境界面は独立したエコシステムを形成します。マクロファウリング分泌物の主成分はタンパク質と多糖類であり、微生物の増殖を促進する富栄養環境を作り出します42、43、44、45。 Perme et al.46 は、フロリダ州の水中鋼橋杭の局所的な深刻な腐食が、マクロ付着物や微生物の影響による腐食に関連していることを発見しました。彼らはまた、マクロファウリング汚染物質によって形成された亀裂がSRBの成長とMICの発達に重大な影響を与えることも発見した。 SRB が支配的な MIC プロセスは、マクロ汚損生物が占拠する閉鎖環境で急速に進行します5。したがって、マクロファウリング被覆率の影響を受ける腐食を研究するには、界面腐食挙動や微生物の存在量と多様性を調べることにより、微生物群集とマクロファウリングの相乗効果による鋼の腐食メカニズムを確立する必要があります。

この研究では、フィールド浸漬実験と実験室特性評価を使用して、カキ（ハードファウリング生物の代表）とホヤ（ソフトファウリング生物の代表）で覆われた高強度低合金鋼表面の腐食挙動を調査しました。我々は、ハイスループットシーケンス技術を使用して、腐食の種類と錆層の組成に基づいて、マクロ汚れ/鋼の界面の錆層の微生物群集の特性を研究しました。さらに、局所的な腐食における微生物の役割に基づいて、カキの分泌物および組織内の微生物群集を調べました。私たちの結果は、界面に形成される不均一な好気性/嫌気性微環境と、マクロファウリング分泌物によって提供される栄養源が、嫌気性細菌の増殖を引き起こし、鋼の腐食を促進することを示しました。この研究は、鋼の腐食に対するマクロ付着物と微生物の相乗効果についての洞察を提供し、微生物の増殖とマクロ付着物の密接な関係の研究に貢献します。

ソフトファウリング生物とハードファウリング生物はすべて、海洋施設に潜在的な脅威をもたらす可能性があります。硬い付着生物の代表である牡蠣は、2 つの複雑な殻部分で保護された柔らかい体で構成されています。カキの殻は主に 97% が炭酸カルシウムでできており、優れた曲げ強度と低い導電性を備えています。一方、ホヤは、柔らかい汚れをもつ生物の代表です。彼らは環境への適応性が高く、強い空間競争力を持っているため、鋼鉄の表面をすぐに占有し、元の底生生物群集の多様性と構造的特徴を変えることができます。

ソフトファウリングおよびハードファウリングで覆われた鋼の腐食挙動を調査するために、鋼試験片を海水に9か月間浸漬しました。次に、汚れた鋼試験片を収集した後、覆われたマクロ汚れを除去しました。カキとホヤで覆われた界面の間では、異なるタイプの腐食が観察されました (図 1)。カキの殻の不規則な形状により完全に覆うことができなかった領域では、局所的に激しい腐食が観察されましたが、ホヤで覆われた汚れた鋼表面では均一な腐食が観察されました。

9 か月の浸漬後の試験片 OY、AS、および SW の鋼表面の肉眼的形態分析。ＳＥＭ画像は、マクロ付着物を除去した後の界面の錆の形態に対応し、レーザー共焦点分光法は、マクロ付着物および錆を除去した後の裸鋼表面全体の形態に対応した。 OY、牡蠣で覆われた鋼鉄の表面。 AS、ホヤで覆われた鋼の表面。 SW、マクロ汚れで覆われていない鋼表面。

SEM 画像と対応するレーザー共焦点分光法によって証拠が得られました (図 1)。マクロ付着物を除去したところ、カキ被覆鋼片（OY）では、外側のさび層に広範囲の剥離が発生し、この領域に不規則な腐食ピットによる局所的な損傷が発生していることがSEM画像から観察されました。ホヤ（AS）で覆われた鋼片では、さび層も緻密ですが、さびの上層に綿状構造が現れました。マクロファウリング（SW）で覆われていない鋼試験片の場合、外側の錆層は緩んで容易に剥がれ落ち、これは長期浸漬後に海水に浸漬された鋼の典型的な形態でした47。マクロファウリングの分泌物がさび層に浸透してさび層の構造を変化させ、マクロファウリングの被覆によって外側のさび層の状態が変化することを発見するのは難しくありませんでした。

一貫して、CLSM の結果は、さび層を除去した後、OY 試験片は重大な局所的損傷と腐食ギャップがあり、著しく破壊された鋼表面を有する一方、AS 試験片は明らかな局所的損傷のない比較的均一な鋼表面を有することを示しました。腐食深さ値の最大差が抽出され、OY 試験片の最大腐食深さ値は 721.0 μm であり、AS (453.048 μm) および SW (521.1 μm) 試験片の値よりもはるかに大きくなりました。平均粗さ値も分析しました。裸鋼表面の Sa 平均値を最大から最小の順に並べると、OY > AS > SW となりました。マクロ汚れの被覆量は鋼表面の粗さに影響を与え、腐食ピットの開始を促進すると考えられていました。しかし、カキの石灰質の殻を覆う環境によって形成された隙間により、これらの腐食ピットがさらに進行し、局所的に深刻な損傷と腐食が発生しました。対照的に、ホヤの被覆によって促進された腐食ピットはシート状につながっているように見え、均一な腐食を示しました。

腐食生成物は、腐食の進行を説明する上で重要な役割を果たします。 XPS を使用して、マクロ汚れと鋼の界面に形成された錆層の元素成分を検出しました (図 2)。腐食生成物のXPS調査スキャンにより、主な元素がFe、C、O、Sであることが明らかになりました。3つの試験片のFe 2p高分解能スペクトル（図2a）は、720.148、711.849、725.349、725.349のピークに分解されました。 50、710.751、および723.552 eVは、それぞれFe0、FeOOH 2p3/2、FeOOH 2p1/2、Fe3O4 2p3/2、およびFe3O4 2p3/2に関連します。一方、713.6 eV (FeS 2p3/2)50 のピークが OY-RU および AS-RU 試料から見つかり、FeS がマクロファウリング/鋼の界面で生成されたことを示しています。この結論は、S 2p 高分解能スペクトルによっても確認できます (図 2d)。 3 つの試料から記録された S 2p スペクトルは、GR(SO42-) の SO42- に対応する 169.6 eV53 の共通ピークで構成されていました。一方、OY-RU および AS-RU 試験片の腐食生成物は、FeS に関連する 161.0 (S2- 2p3/2) および 163.0 eV (S2- 2p1/2) のピークに分解されました。 O 1s 高分解能スペクトル (図 2c) は、それぞれ OH- と O2- に関連する 530.0 eV と 531.6 eV のピークに分解されました 55。 C 1s高分解能スペクトル（図2e）は、289.1 eVのカルボキシレート基（O = C – O）、284.6 eVのC – C結合、および286.1 eVのC – O結合の3つのピークを明らかにしました。 C-C は脂肪族炭素に由来する可能性があり、C-C は多糖類またはペプチド/タンパク質の酸素に単結合した炭素に由来する可能性があります 56,57。 EPS に由来するカルボン酸基 (O=C-O) は、バイオフィルム内に捕捉された一般的な細菌の代謝産物である有機酸の蓄積の証拠であった可能性があります 58。生成された EPS と FeS は、硫酸塩還元細菌がマクロファウリング/鋼の界面での MIC プロセスに関与している可能性があることを示しました。

9ヶ月の浸漬後にマクロファウリング/鋼の界面に形成された錆層のXPSスペクトル。 a サーベイスキャン、b Fe 2p 高分解能スペクトル、c O 1s 高分解能スペクトル、d S 2p 高分解能スペクトル、e C 1s 高分解能スペクトル (OY-RU、AS-RU、SW-)る。 OY-RU、カキと鋼の界面の錆層またはバイオフィルム。 AS-RU、ホヤと鋼の界面の錆層またはバイオフィルム。 SW-RU、マクロ汚れで覆われていない鋼鉄界面の錆層またはバイオフィルム。

FeSがマクロファウリング/鋼の界面で生成されたことをさらに調査するために、フーリエ変換赤外（FT-IR）分光計を使用してさび層の特性を調べ、得られたスペクトルでさまざまな腐食生成物に対応する特徴的な振動モードを調べました（図3a）。その結果、マグネタイト Fe3O4、GR(SO42-)、レピドクロサイト γ-FeOOH、アカゲナイト β-FeOOH、針鉄鉱 α-FeOOH、マキナナイト FeS の存在が確認されました。 1020 cm-1 のピークは γ-FeOOH3,59,60,61 の Fe-O 振動モードとして特定され、795 および 885 cm-1 のピークは α-FeOOH3,59,60,61 に由来することが判明しました。、420、665、および840 cm-1のピークはβ-FeOOH3、47、61、62、63に割り当てられました。 Fe3O4 の典型的な Fe-O 結合ピークは 463 および 570 cm-1 3,61,64 で観察されました。さらに、1021 および 1117 cm-1 のピークは FeS3,61,65,66 に帰属され、660 cm-1 のピークは GR(SO42-)3,61,67,68 に帰属されました。 1400〜1450 cm−1の範囲のスペクトルバンドは、MIC65に関与するバイオフィルムの主成分として以前に報告されている、タンパク質および多糖類からのCOOH中のC=Oの対称伸縮およびO-Hの変形に対応していた。 69. FeS とバイオフィルムの存在は、モアクロファウリングと鋼の界面での SRB の成長をさらにサポートします。

9 か月の浸漬後にマクロ付着物と鋼の界面に形成された錆層の a FT-IR スペクトルおよび b XRD スペクトル。 OY-RU、カキと鋼の界面の錆層またはバイオフィルム。 AS-RU、ホヤと鋼の界面の錆層またはバイオフィルム。 SW-RU、マクロ汚れで覆われていない鋼鉄界面の錆層またはバイオフィルム。

さび層についてもXRDスペクトル分析を実施しました（図3b）。結果はまた、Fe3O4 (ICCD ファイル 76-0958)、GR(SO42-) (ICCD ファイル 13-0092)、γ-FeOOH (ICCD ファイル 74-1877)、α-FeOOH (ICCD ファイル 08-0098)、およびβ-FeOOH (ICCD ファイル 08-0098) は、海水浸漬環境における主要な腐食生成物でした 70,71。しかし、マクロファウリングで覆われた界面では、SRB の成長により FeS が形成されました (ICCD ファイル 37-0477)。

アンプリコン配列決定は、鉄鋼表面の錆とバイオフィルムにおける微生物群集の経時的な違いと動態を理解するために実施されました。 Illumina NovaSeqシーケンスプラットフォームを使用して、標本AS-RU、OY-RU、OYS、OYT、SW-RUから合計911,800の有効タグと19,201の運用分類単位（OUT、類似性97％）を取得しました（補足表1）。、合計934属を検出しました。 19,201 個の OUT を分析し、並列標本の平均を取った後、花図とベン図が得られ (図 4)、5 つの標本で共有される 159 個の OUT があることがわかりました。 SW-RU の OUT が最も高く、値は 4816 でした。次に OY-RU と AS-RU が続き、値はそれぞれ 1410 と 814 でした。これは、錆びた環境が微生物の増殖に有利であることを意味し、微生物群集の存在量が多いことに対応しています。対照的に、カキ分泌物の微生物群集の存在量は最も低かった。

a 花の図と b ベン図。 OY-RU、カキと鋼の界面の錆層またはバイオフィルム。 AS-RU、ホヤと鋼の界面の錆層またはバイオフィルム。 SW-RU、マクロ汚れで覆われていない鋼鉄界面の錆層またはバイオフィルム。 OYS、カキの分泌物中のバイオフィルム。 OYT、カキの組織内のバイオフィルム。

微生物群集の多様性を示すために、標本 AS-RU、OY-RU、OYS、OYT、および SW-RU の α 多様性を分析しました。

バイオフィルムと各環境における微生物群集の存在量と多様性指数が得られました（図5aおよび補足表1）。 Chao1、Ace、Shannon インデックス、インデックス、および OTU の値を最大から最小の順に並べると、SW-RU > OY-RU > AS-RU > OYT > OYS となりました。これらの指標は群集の存在量と多様性に関する情報を反映しており、マクロ汚損被覆のない鋼表面上の微生物群集が 3 つのさび層標本 (SW-RU、OY-RU、AS-RU) の中で最も豊富さと多様性を持っていることを示しています。マクロ汚れの被覆は、間接的にさび層内の微生物群集の存在量と多様性の減少につながりました。 3 つの試験片の界面腐食状態を比較することにより (図 1)、少数の腐食性微生物のみが MIC プロセスで重要な役割を果たしていると考えられました。特に、OYS 標本は、カキに関連する 3 つの標本 (OY-RU、OYS、および OYT) の中で微生物群集の存在量と多様性が最も低かったです。図 5b は、分散分析とそれに続く Tukey-Kramer 多重比較検定を使用して取得された、Shannon 指数と Chao1 指数の p 値を示しています。これらの差は統計的に有意であり (p 値 < 0.05)、さび標本 (SW-RU、AS-RU、および OY-RU) の微生物群集がより複雑であることを示しています。さび層がマクロファウリングで覆われていると、さび層内の微生物群集は酸素濃度の勾配に応じて異なって変化し、そのような微生物多様性の違いは覆われた界面の生態系を反映していました。

各環境における微生物群集のアルファ多様性推定ツール。 a Chao1 インデックス、ACE インデックス、シャノンインデックス、およびグループ AS-RU、OY-RU、OYS、OYT、および SW-RU の α 多様性推定量の観測された OTU ボックスプロット。ボックスの中央の線、ボックスの上部と下部、およびひげはそれぞれ中央値、25 パーセンタイルと 75 パーセンタイル、最小値から最大値までの値を表します。エラーバーは、三重サンプルの標準偏差を表します。 b 分散分析とそれに続く Tukey-Kramer 多重比較検定を使用して取得された、Shannon 指数と Chao1 指数の p 値。赤い背景は、p 値 < 0.05 のペアを表します。

さらに、16S rRNA 遺伝子の希薄化曲線とランク存在量曲線を使用して、標本の多様性を説明することもできます（補足図1）。希薄化曲線の場合、曲線が平坦化することは、配列決定データの量が徐々に適切になること、つまりデータが増えても少数の新種しか生成されないことを意味します。ランクの豊富さは、標本内の種の豊富さと均一性を直感的に反映します。水平方向では、種の豊富さが高くなるほど、x 軸上の曲線のスパンが大きくなります。垂直方向では、曲線が滑らかであればあるほど、種の分布はより均一になります。希薄化曲線（補足図1a）からわかるように、希薄化曲線のOUT番号を最大から最小の順に並べ替えると、SW-RU > OY-RU > AS-RU > OYT > OYSとなり、次と同じ傾向を示しました。図5および補足表1。しかし、SW-RU標本の曲線は配列番号が増えると安定しなくなり、SW-RU標本の細菌の多様性が予想よりもはるかに大きいことが示唆されました。 SW-RU標本は微生物の存在量と多様性が最も高かったにもかかわらず、ランク存在量曲線に示されているように、それらの種の均一性はAS-RUおよびOY-RU標本の均一性よりも低かった（補足図1b）。 OY-RU 標本の最も不均一な種分布は、石灰質の殻で覆われた特殊な環境が微生物群集に大きな違いをもたらすことを反映しています。

異なる標本間の微生物群集組成を比較および分析するために、標本 AS-RU、OY-RU、OYS、OYT、および SW-RU の β 多様性を分析しました。

OTUレベルに基づくノンメトリック多次元尺度法（NMDS）分析結果を使用して、点間の距離による試験片AS-RU、OY-RU、OYS、OYT、SW-RU間の差異の度合いを反映しました（図1）。 6a)、生態学的データの非線形構造をよりよく反映できます72。 NMDS の結果から、試験片 OYT と OYS には明らかな類似点があり、試験片 OY-RU と AS-RU には明らかな類似点があることがわかりました。 SW-RU 標本は長い距離を有しており、マクロファウリングの被覆がさび層内の微生物群集の変化につながることをさらに証明しました。

a ブレイ-カーティス間距離のノンメトリック多次元尺度法（NMDS）図と、 b 試験片間の Unifrac 距離と重み付けされていない Unifrac 距離に基づく UPGMA クラスターツリー細菌。図 1、2、および 3 は、AS-RU、OY-RU、および SW-RU の界面に沿った異なる場所でサンプリングされた 3 つの並行した標本を表します。

Unifrac 距離と重み付けされていない Unifrac 距離に基づく UPGMA クラスターツリーは、同じ結果を示しました (図 6b)。標本 SW-RU には、他の 4 つの標本と共有する他の微生物群集が含まれていました。これは、マクロ汚損と鋼被覆界面の特殊な環境が特徴的な微生物群集の存在につながり、マクロ汚損分泌物も微生物群集の一部を共有していることを意味します。ある程度。さらに、マクロファウリングで覆われた試験片（OY-RUおよびAS-RU）の変化は、覆われていない試験片（SW-RU）の変化よりも大きかったため、微生物群集の変化と腐食の進行の間に相関関係が見られました。。

門レベル（図7a）、綱レベル（図7b）、属レベル（図7b）における標本OYT、OYS、OY-RU、AS-RU、およびSW-RUの16S rRNA遺伝子配列の相対存在量。 7c) (相対存在量 > 1%) は、微生物群集の組成を分析するために取得されました。合計 82 門、171 綱、934 属が検出されました。

微生物群集の分類学的構成。標本 OYT、OYS、OY-RU、AS-RU、および SW-RU から得られた上位細菌 16S rRNA 遺伝子配列 (相対存在量 > 1%) の a 門レベル、b クラスレベル、および c 属レベルの組成分析。 d LEfSe分析（線形判別分析（LDA）、ログスコア>3.5、P = 0.05）によってさび関連グループ（OY-RU、AS-RU、およびSW-RU）で特定された識別分類群の系統図。各分類法の相対存在量は、3 つの分類法の平均値でした。

5 つの標本で観察された微生物群集の主な門は、プロテオバクテリア (38.6 ～ 96.7%)、ファーミクテス属 (1.5 ～ 96.7%)、シアノバクテリア (-10.2%)、バクテロイドータ (-10.2%)、カンピロバクテロタ属 (-5.3%)、デスルフォバクテロタ属でした。（−5.3％）、放線菌（−2.7％）、放線菌（−3.0％）、ヴェルコバクテリオタ（−1.6％）、およびそれらの相対存在量は標本ごとに異なります（図7a）。たとえば、プロテオバクテリアとファーミキューテスは一緒に検出されました。すべての標本から、標本 OYT、OY-RU、AS-RU、AS-RU に共通するバクテロイデス属が検出されました。これら 3 つの門を除いて、マクロファウリングと鋼の境界面のさび層にはより豊富な群集分布があり、カンピロバクテロタ属、放線菌属、およびベルコバクテリウム属が OY-RU および AS-RU 標本に共有されていました。特に、OY-RUにはDesulfobacteria門とActinobacteria門があり、カキの石灰質の殻に覆われた環境により、さび層内のProteobacteriaとBacteroidotaの相対的な存在量が減少し、Desulfobacterota門に置き換わりました。このような違いは、酸素濃度や分泌状態の影響を受ける可能性があります。 Desulfobacterota のほぼすべての種が SRB であるため 73,74 、これはカキと鋼の境界面の環境が嫌気性であることを証明しています。 Desulfobacterota は局部腐食を促進する主な細菌であることが証明されており、これは牡蠣と鋼の界面で生成する FeS をよく説明しており、Desulfobacterota は界面の腐食ピットの形成にある程度関与していると考えられていました。 Desulfobacterota に加えて、Proteobacteria および Bacteroidetes が、海洋環境の腐食した鋼表面で主要な優勢な門であることが証明されています8。鉄と硫黄の酸化還元サイクルに関連する微生物のほとんどはプロテオバクテリアに属していました75。プロテオバクテリアの一部の細菌はバイオフィルムの形成に非常に重要です76。海水への短期間の浸漬では、鋼表面上のバイオフィルムにおいてバクテロイデスが優勢な門であることが確認された77。バクテロイデス属の細菌には多数のコーディング遺伝子が含まれており、バイオフィルムを利用して複雑なポリマー (POmp や DOM など) を分解して嫌気的環境を作り出すのが得意です 78。ファーミクテス属および放線菌の細菌は、脱水や極端な環境に耐えるために胞子を生成するさまざまなグラム陽性細菌を含め、主にパイプライン環境で見られます79。放線菌は、エネルギー伝達経路における重要な微生物の 1 つでもあり、過酷な環境でも生存し、孔食を引き起こす可能性があります 79,80。

相対存在量に従ってランク付けされた上位10クラス（図7b）の中で、ガンマプロテオバクテリ属クラスがすべての検体から検出され、検体OYT、OY-RU、AS-RU、SW-に共通するバクテロイディア属、バチルス属、およびクロストリジウム属のクラスが検出されました。る。特に、クラスアルファプロテオバクテリアはさび標本OY-RU、AS-RU、SW-RUに共通しています。マクロファウリングで覆われた標本 (OY-RU および AS-RU) に共通するクラスは、Verrucomicrobiae、Campylobacteria、および Acidimicrobiia です。これらとは別に、OY-RU にはシアノバクテリア属とデスルホビブリオニア属のクラスがありました。これらの綱のうち、ガンマプロテオバクテリア綱およびアルファプロテオバクテリア綱はプロテオバクテリア門に属し、バチルス綱およびクロストリジウム綱はファーミキューテス門に属し、バクテロイディア綱はバクテロイドータ門に、ヴェルココミクロビア綱はヴェルココミクロビオタ門に、カンピロバクテリア綱はカンピロバクテロタ門に属した。統計によると、培養可能な腐食性細菌のうち、アルファプロテオバクテリアとガンマプロテオバクテリアが 75% を占めています。

海水中の鋼の暴露およびマクロ汚れの被覆により、鋼表面とマクロ汚れ／鋼の界面との間に錆層およびバイオフィルムの異なる形成が生じた。結果は、属レベルであっても微生物組成の顕著な変化を示しました（補足表2および図7c）。各標本の相対存在量が 1% を超える上位 OTU に焦点を当てました。これは、標本OYT、OYS、OY-RU、AS-RU、およびSW-RUでそれぞれ76.5%、94.3%、31.1%、39.1%、および52.2%をカバーしました。

通常、微生物が鋼の表面に定着すると、微生物が分泌する細胞外多糖類が金属表面の有機物質および無機物質と反応して細胞外高分子物質（EPS）を形成します。その後、細菌は EPS とともに金属表面に付着し、バイオフィルムを形成します。バイオフィルムの主な特徴は、内部の pH、溶存酸素 (DO)、イオン濃度、有機物含有量が海水とは大きく異なることです。一般に、腐食能力を持つ海洋細菌の多くは、鉄、硫黄、その他の元素の循環過程に関与しており、金属表面の陰極反応過程と陽極反応過程を変化させることによって腐食過程に関与しています。細菌の種類と代謝特性に応じて、海洋の主な腐食性細菌は硫酸塩還元細菌（SRB）、鉄酸化細菌（IOB）、鉄還元細菌（IRB）、酸生成細菌（APB）に分類できます。、スライム生成菌（SPB）など。

さびバイオフィルム標本（SW-RU、AS-RU、OY-RU）を比較することにより、Woeseia属、Pseudomonas属（SPB）、Comamonas属、Ruegeria属（SPB）、Brevundimonas属、Desulfovibrio属（SRB）、Desulfobulbus属（SRB）、および古細菌 Candidatus_Nitrosopumilus は最終的に増加しましたが、シュードアルテロモナス属、メチルオーバーサティリス (NRB) 属、および乳酸桿菌属はマクロファウリングの被覆率とともに減少しました。

Desulfovibrio と Desulfobulbus は典型的な SRB81 です。 SRBは金属基質から直接電子を獲得して自らの生命活動を維持できる従属栄養細菌です。 SO42−はSRBの作用によりS2−に還元され、マクロファウリング/鋼の界面に典型的な腐食生成物FeSが残り、これはさび層でのFeSの検出と一致しました（図2）。 Deltaproteobacteria 綱に属する Desulfovibrio は、海洋腐食環境のさび層で主な属として観察され、海洋 MIC の主な原因であることが証明されています 7,13,82。アルファプロテオバクテリア綱に属するブレバンディモナスは、構造用鋼に腐食を引き起こす可能性のある主要な微生物の 1 つです80。 Woeseia は、通性嫌気性、グラム陰性、オキシダーゼ陰性、カタラーゼ陽性の化学従属栄養性海洋微生物で構成される通性嫌気性微生物の 1 つです 83。通性呼吸モードを持つ機能的な微生物群は、海洋環境における成熟したバイオフィルムの典型的な特徴とみなされました 32。表面バイオフィルムを支配するシュードモナス属やルゲリア属などのバイオフィルム形成属は、典型的な SPB でした。これらの微生物は、嫌気性および酸性環境を生成する可能性があります。ラクトバチルス属の細胞外ポリマーは、炭素鋼界面の結晶を移動させることによって錆層の安定性を変化させ、炭素鋼の腐食速度を低下させる可能性がある84。注目すべきことに、マクロファウリングの範囲に応じてシュードアルテロモナスの存在量が大幅に減少した。これは、デスルフォビブリオの存在量の増加に対応しました。 Wu ら 85 は、天然海水中での低炭素鋼 Q235 上の Desulfovibrio と Pseudoalteromonas の腐食を研究し、Pseudoalteromonas が海水中の DO を枯渇させ、これが Desulfovibrio の生命活動の基本条件を提供し、微生物腐食を引き起こすことを発見しました。 DO の減少によりさび層の優勢菌が好気性菌から嫌気性菌に変化し、鋼表面が MIC の影響を受けるようになりました。メチルオーバーサティリスは NRB の 1 つとして観察され、合成ベントナイト間隙水中の炭素鋼の MIC プロセスで重要な役割を果たしていることが証明されました 86。コマモナスは天然ガスのパイプラインで発見され、腐食プロセスにも関与する最も頻繁に遭遇するバクテリアの 1 つでした 87。古細菌の場合、Nitrososphaeria 綱に属する Candidatus_nitrosopumilus がマクロファウリングと鋼鉄の界面で重要な位置を占めていました。この属のメンバーは、アンモニアの好気性酸化によって化学合成独立栄養的に亜硝酸塩を生成し、還元窒素に対して高い特異的親和性を有し、従属栄養性のバクテリオプランクトンや植物プランクトンとうまく競合することが保証されました。これまでの研究では、細菌は主に表面定着に寄与し、古細菌はめったに見つからないことが示されています。しかし、本研究では、古細菌のメンバーがマクロファウリングオーバーレイ界面から特定されました。マクロファウリングの影響による腐食におけるそれらの役割は再評価される必要があります。

LEfSeはさらに、さび関連標本（図7d）およびカキ関連標本（補足図2）に豊富な特定の分類群を識別するために使用されました。この結果から、Desulfurivibrionaceae を含む Desulfurivibrionaceae 科がさび関連標本の中で OY-TU 標本に豊富に含まれていることがわかり、ここでのカキ/鋼界面の微生物群集における OY-TU の重要な役割がさらに証明されました。

まとめると、鋼表面上のマクロ汚れの被覆は、海水環境における鋼の腐食プロセスによって形成されるさびバイオフィルムと比較して、元の微生物群集の組成に異なる、しかし持続的な影響を引き起こした。栄養が乏しい海水環境では、マクロファウリング分泌物に含まれるタンパク質と多糖類が微生物の増殖に必要なエネルギーを提供し、最初に鋼の表面に付着していた微生物の増殖を刺激しました。その後、上層の無酸素環境の形成に伴い、微生物群集の多様性の変化を伴い、嫌気性細菌の存在量が増加し始めました (SRB で表されます)。マクロファウリング微生物の分泌は、SRB の増殖のための炭素源を提供します。炭素源は、微生物細胞および炭素含有代謝産物の形成のための炭素源として使用される栄養素です。 SRB88、89、90、91、92、93、94 によって推進される MIC プロセスにおいて炭素源が重要な役割を果たしていることが実証されています。 Liuらによる研究89は、SRBが有機炭素源欠乏下でも生存し、よく成長できることを示した。さらに、バイオフィルムの培養時間が長いほど、鋼の腐食速度は速くなります。彼らはまた、有機炭素欠乏によるSRBの存在下でイミダゾリン誘導体によって引き起こされる鋼の腐食抑制をCO2飽和海水中で調査し、有機炭素の非存在下で高い初期カウントでSRBによって腐食が抑制されることを発見しました。しかし、SRB の初期カウントが減少すると、腐食速度が加速されました 88。 Zhao et al.92は、酸生成性硫酸塩還元バイオリアクターの開始段階における、硫化物生成性細菌群集に対するさまざまな炭素源の影響を調査した。彼らは、乳酸塩、酢酸塩/エタノール、グルコース、糖蜜を炭素源として使用すると、各バイオリアクター内の優勢な細菌群集の 16S rRNA 遺伝子の多様性が増加する傾向があることを観察しました。

マクロファウリングの被覆条件下での微生物群集機能の変化をより適切に特定するために、PICRUST予測を使用して機能遺伝子を分析しました（図8）。界面に対するカキの影響（図8a）、界面に対するホヤの影響（図8b）、およびカキの分泌物の影響（図8c）を別々に検討した。マクロ汚れと鋼の界面の微生物群集は、マクロ汚れの被覆されていない鋼表面と比較して異なる反応を示すことが判明した（図8a、b）。カキで覆われた界面（図8a）では、遺伝情報処理リボソーム生合成と膜輸送処理ホスホトランスフェラーゼシステム（PTS）が覆われた低酸素環境によって阻害され、代謝の酸化的リン酸化が強く刺激されました。ホヤで覆われた界面（図 8b）の場合、アミノ酸代謝（バリン、ロイシン、イソロイシン分解、トリプトファン代謝、フェニルアラニン代謝、リジン分解など）、脂質代謝脂肪酸代謝、エネルギー代謝（酸化的リン酸化、メタン代謝など）、原核生物の炭素固定経路）、生体異物の生分解と代謝、カプロラクタムの分解、テルペノイドとポリケチドの代謝、ゲラニオールの分解、およびその他の二次代謝産物の生合成（ブチロシンとネオマイシン生合成およびベタレイン生合成）は、遺伝情報処理リボソームに伴って強く刺激されました。生物発生および膜輸送処理リン酸転移酵素システム (PTS) も阻害されました。マクロファウリングの被覆率が、さびバイオフィルム内の微生物群集の機能経路に一定の影響を与えていることがわかりました。さらに、マクロファウリングの分泌物の役割も無視できませんでした (図 8c)。見てわかるように、界面さびバイオフィルムの形成中に膜輸送（トランスポーターやABCトランスポーターなど）が大幅に促進されました。

PICRUSt予測を用いた微生物群集の潜在的機能。微生物群集の機能経路を、a 牡蠣被覆あり/なし、b ホヤ被覆あり/なし、c 群と牡蠣の分泌からさび病までの微生物群落を比較した。左の列は各経路の相対的な存在量を示し、右の列はグループ間の差異を示しました。エラーバーは、三重サンプルの標準偏差を表します。 d 微生物群集の末端電子受容に関連する重要な機能遺伝子の豊富さ、これらの遺伝子の機能は補足表3から見つけることができます。有意差（P < 0.05）はT検定によって分析されました。

マクロファウリングの適用により、さびバイオフィルム内の微生物群集の機能経路が変化しました。したがって、末端電子受容に関連する重要な機能遺伝子がさらに同定されました（図8d）。酸素呼吸（coxA-DおよびccoN-Q）、脱窒（narおよびnapF-H）、鉄（mtrおよびmtrA-C）、硫酸還元（dsrA、BおよびcysI、J）に関連する遺伝子が観察された。すべての標本で確認されました。驚くべきことではないが、異化性硫酸塩還元プロセスに関連する重要な遺伝子 dsrA および dsrB は、覆われた無酸素環境のため、カキで覆われた標本 (OY-RU) では標本 AS-RU および SW-RU と比較して有意に刺激されました (P < 0.05)。特にカキの石灰質の殻で覆われた領域）、これは分類学的分析と一致しました（図7）。対照的に、cysI や cysJ などの同化的硫酸塩の減少に関与する重要な遺伝子は、標本 OY-RU では減少していました (P < 0.5)。カキ/鋼の界面の硫酸塩消費量はホヤ/鋼の界面の硫酸塩消費量よりも多く、汚れのない被覆界面の硫酸塩消費量よりも多かった。私たちは、SRB の異化性硫酸塩の減少が硫酸塩の消費が重要である理由の 1 つであると考えました。微生物の同化による硫酸塩の減少は、無酸素界面（牡蠣と鋼の界面）を覆う硫酸塩の枯渇を大幅に促進する可能性がある。

このこの法則は、硫酸に関連する機能遺伝子以外にも、napH、napG、nar、coxC、ccoN、ccoO、ccoP、ccoQなどの機能遺伝子にも反映されていました。カキと鋼の界面（OY-RU）のさびバイオフィルムでは、napH、napG、および nar 遺伝子が有意に濃縮され（P < 0.05）、遺伝子 coxC、ccoN、ccoO、ccoP、および ccoQ が有意に減少しました（P < 0.05）。。この観察は、カキで覆われた無酸素界面が微生物の脱窒を刺激するが、微生物群集の酸素呼吸プロセスを弱めることを示した。鋼表面の嫌気呼吸モードの強化は、嫌気領域が存在する厚く複雑な錆層内に不均一な嫌気微環境が形成されたためである。微生物の脱窒プロセスは、無酸素海洋環境で観察されているような嫌気性条件下で起こる可能性がある7,95,96。

海洋環境では、マクロ微生物や微生物が孔食や金属表面の隙間腐食などの局所的な攻撃を引き起こす可能性があり、これを防ぐためにさまざまな防汚手段が使用されています97,98。この研究では、試料を同じ場所の海水中に9か月間置いた場合、マクロ付着物で覆われた鋼鉄の表面錆と覆われていない鋼表面錆において、微生物群集の組成と多様性に大きな違いが観察されました。一方、界面形態観察の結果から、付着したカキやホヤが、付着した鋼表面に複雑な海洋腐食を引き起こしており、カキと鋼の界面では局所腐食として現れ、ホヤと鋼の界面では均一な腐食が発生していることが判明した。また、さび組成の結果から、針鉄鉱、アカジェナイト、レピドクロサイト、マグネタイト、GR(SO42-) に加えて、マキナワイトがマクロファウリング/鋼の界面でのみ生成されることがわかりました。これらはすべて、MIC がマクロファウリングと鋼鉄の界面で発生し、SRB が加速された腐食プロセスに関与していることを示唆しています。そこで、我々は、マクロ汚れで覆われた界面錆びにおける微生物群集の組成と潜在的な機能についての比較研究を実施した。 3 セットの標本 SW-RU、OY-RU、AS-RU は、マクロ汚れで覆われた界面錆層バイオフィルム内の微生物群集の定量分析と、界面腐食プロセスに対する微生物群集の寄与を裏付けるデータを提供しました。

私たちの初期の結果は、カキで覆われた界面では、「陰影効果」の存在により、しっかりと付着したカキの石灰質の殻が、界面のしっかりと覆われた領域での酸素と物質の拡散を妨げ、その結果、カキが形成されることを示しました。酸素濃淡電池の腐食により、隙間が形成された箇所の腐食速度がさらに加速されます3。このプロセスの最も重要なプロセスは、金属腐食の陰極プロセスを決定するだけでなく、酸素濃度の変化によるさびバイオフィルム内の微生物の組成も決定します。この研究では、マクロファウリングで覆われていない試験体（SW-RU）と比較して、カキで覆われた界面（OY-RU）のさび層バイオフィルムに異なる微生物群集と顕著な局所腐食が観察され（図1）、以下のことが強く示唆されました。このような腐食は MIC に関連していました。カキが鋼の表面を覆っているため、硫酸イオン濃度が高いため、この環境では SRB が容易に濃縮されます 82,99。これは、強化された SRB (図 7) と主要な対応する遺伝子 dsr (図 8) によって証明されました。カキと鋼の界面での硫酸塩の大量消費と微生物による硫酸塩の高度な還元により、バイオフィルムが錆び、石灰質の殻の「陰影効果」により SRB の嫌気的環境が作られることを意味しました。 SRB 誘発 MIC は腐食ピットの形成と発達を促進し、これにより海水中の硫酸塩の還元が誘導され、FeS の生成が引き起こされました。したがって、我々は、カキの影響を受ける腐食過程において、カキの幼生が錆びた鋼表面に定着し始めるまでは、SRB が海水中の鋼の MIC 発生の主な原因ではないと提案した。カキの定着中に、バイオフィルム形成属 (SPB) のシュードモナス属とルゲリア属が最初に鋼の表面に付着し、バイオフィルムを形成しました。カキが鉄鋼表面に定着し、覆われた領域に局所的な嫌気性ゾーンと不均一な微環境が形成された後、SRB および SPB 関連細菌が増殖し、さびバイオフィルムの移行を促進しました（図 7）。これらは、カキオーバーレイ界面での SRB の濃縮を伴って、嫌気性 NO3 還元関連遺伝子が有意に濃縮され（P < 0.05）、遺伝子 coxC、ccoN、ccoO、ccoP、および ccoQ が有意に減少した（図 8d）理由を説明できます。 (図7)。これらの要因により、カキと鋼の界面の隙間腐食が促進されました。

当然のことながら、これらの現象はホヤと鋼の界面で同じ隙間腐食を引き起こしませんでした。これは、優勢な微生物の豊富さと、ホヤと鉄、およびカキと鉄の界面における酸素濃度の違いによって説明できます。覆われたホヤの下は、ホヤの体の導電性とイオン拡散能力により好気環境が保たれていました。高濃度の酸素は SRB の活性を低下させるため、SRB がホヤと鋼の界面での MIC プロセスに関与することはほとんどありません。逆に、カキと鋼の界面に存在するギャップと分泌物によって提供される栄養素により、SRB の活性が高くなり、特定の部位で重度の MIC が発生します。

要約すると、現場での実験、実験室での特性評価、およびハイスループットシーケンス技術を利用して、深刻な微生物影響による腐食（MIC）を引き起こす可能性がある、マクロ汚れと鋼の界面での潜在的な微生物群集を調査しました。この研究では、マクロファウリングによって覆われた微生態環境と、マクロファウリングの分泌物によって提供される栄養源が、界面における微生物群集の存在量と多様性を刺激していることが判明した。具体的には、硫酸塩還元細菌 (SRB) が MIC プロセスに関与していることが判明しました。 MIC プロセスは、ハードファウリングで覆われた界面とソフトファウリングで覆われた界面で大きく異なることが判明しました。ホヤと比較すると、カキの石灰質の殻のイオン拡散率が低いため、カキと鋼の界面には局所的な嫌気性ゾーンが形成されます。この嫌気性環境は SRB の成長を刺激し、FeS 含有量の増加と局所的な深刻な腐食を引き起こしました。特に、SRBのDesulfovibrioおよびDesulfobulbus、ならびにSRB関連機能遺伝子dsrが増加する一方、酸素関連機能遺伝子coxC、ccoN、ccoO、ccoPおよびccoQが減少することが判明した。

この論文では、微生物の存在量と多様性が高いと鋼の腐食が直接促進されるという仮説を裏付けるデータは提供されていません。驚くべきことに、この研究では、マクロ汚れが付着していない鋼表面は微生物群集が最も豊富であるにもかかわらず、MIC の深刻度が低いことが判明しました。私たちは、存在する多数の微生物群集のうち、実際に界面 MIC プロセスに関与しているのはほんの一部であり、SRB が重要な役割を果たしていると考えました。 MIC プロセスでは、局所的な微環境の変化と嫌気性細菌の増殖による微生物群集の違いに注意を払う必要があります。そうすることで、界面での局所的な腐食メカニズムをより深く理解し、複雑な腐食プロセスにおける微生物の特定の寄与を正確に定量化することができます。

この作業では、次の元素組成（重量％）を持つ高強度低合金鋼（AISI 4135、首鋼新鋼有限公司、中国）が試験鋼として選択されました: C 0.399、S 0.0144、P 0.0146 、Ｓｉ０．２９３、Ｍｏ０．２０４、Ｍｎ０．５０９、Ｎｉ０．０８０４、Ｃｒ０．９０３、およびＦｅバランス。直径 1 cm、厚さ 1 cm の円筒形の標本を選択し、樹脂に埋め込み、表面積 0.785 cm2 を露出させました（図 9a）。これらの標本は、マクロファウリングが付着しやすい干潮線より下の海水に浸漬されました。フィールド暴露サイトは、中国青島市膠州湾の桟橋沖に位置しました（北緯 120 度 15 分 4 秒、東経 35 度 59 分 11 秒）。 2021年3月1日から2021年12月1日までの9か月間海水に浸漬した後、円筒形の標本はカキで覆われ（図9b）、ホヤで覆われ（図9c）、マクロ付着物で覆われていなかった（図9d）。）を取得しました。マクロファウリング微生物の付着は制御できないため、実験計画は次のとおりです。複数の平行な標本を同じ場所に吊り下げ、マクロファウリングの範囲を一定の間隔で観察しました。カキやホヤが付着している標本をいくつか確認した結果、それらを対象標本として選定した。一定期間後、カキとホヤが付着している対象標本を別々に採取し、対照群としてマクロ付着物が付着していない標本も選択して採取した。次に、さらなる配列決定とさびの組成分析のために、現場のさび層とバイオフィルムがマクロファウリング/鋼の界面で収集されました。標本を収集した後、すべてのさび標本とバイオフィルムを滅菌遠心分離管 100 に移しました。 3 つの平行な試験片が異なる点で収集され、SW-RU (マクロ汚れで覆われていない鋼の界面の錆層またはバイオフィルム)、AS-RU (ホヤと鋼の界面の錆層またはバイオフィルム)、OY-に割り当てられました。 RU（牡蠣と鉄の界面の錆層またはバイオフィルム）、OY（牡蠣の分泌物中の錆層またはバイオフィルム）、およびOYT（牡蠣組織の錆層またはバイオフィルム）。さび標本 (SW-RU、OY-RU、および AS-RU) の場合は、まず鋼基材表面から覆われたマクロ付着物を除去し、次に滅菌鉗子を使用してさび層とバイオフィルムを収集します。 OYS および OYT 標本の場合、まず滅菌鉗子を使用してカキの殻をこじ開けました。次に、滅菌ピペットを使用してカキ分泌物 (OYS) を収集し、滅菌外科用ブレードを使用してカキ組織 (OYT) を切断して収集しました。収集されたすべての標本はアイスボックスに保管され、できるだけ早く研究室に輸送され、さらなる分析のために-20°Cで保管されました。

円筒形の試験片。 b–d 円筒形の標本 b はカキで覆われ、c はホヤで覆われ、d は海水に 9 か月間浸漬した後でもマクロファウリングで覆われていません。

マクロ付着物/鋼の界面の形態観察および錆層分析では、最初に覆われたマクロ付着物を除去し、次にマクロ付着物/鋼の界面の錆の組成と形態の特性評価を実行しました。マクロ汚れを除去した後の錆で覆われた鋼表面の形態を走査型電子顕微鏡 (SEM、Regulus 8100、日立、日本) によって調査しました。 20 vol% 塩酸と 1 vol% ヘキサメチレンテトラミンを使用して錆層を除去した後、錆を除去した鋼表面を 3D 測定レーザー顕微鏡 (LSCM、LEXT 3D OLS5000、オリンパス、日本) で観察しました。収集した錆層をグリセロールと混合し、酸化を避けるために凍結真空乾燥し、真空容器に保管しました。 X 線光電子分光法 (XPS、EscaLab 250Xi、Thermo Fisher Scientific、アメリカ)、X 線回折 (XRD、Ultima IV、リガク、日本)、およびフーリエ変換赤外分光法 (FT-IR、Nicolet iS10、Thermo Fisher Scientific、米国）の技術が錆の特性評価に使用されました。 XPS 分析では、単色 Al Kα 放射線とアルゴン支援電荷補償を備えた Thermo Fisher ESCALAB 250Xi 分光計を使用して XPS データを収集しました。詳細なスペクトルには、ステップサイズ 0.05 eV、滞留時間 100 ms、通過エネルギー 10 eV が使用されました。電圧に起因する電子スペクトルの変化を除去するために校正が行われました。スペクトルは90°の取り出し角で記録され、すべての結合エネルギーは284.6 eVに設定されたC 1s 信号に電荷補正されました。酸化鉄の特性評価のために、C 1s、S 1s、O 1s、および Fe 2p ピークの高解像度スキャンが取得されました。 XRD 分析では、Cu Kα 放射線 (λ = 1.5406 Å) を備えた Riraku XRD 回折計を使用して錆サンプルの特性を評価しました。回折データは、5°/分の走査速度で 5 ～ 90°の 2θ 範囲にわたって収集されました。 FT-IR 分析では、分光的に純粋な乾燥 KBr を真空下で使用して、錆サンプルを微粉末に粉砕し、ディスクに圧縮しました。スペクトルは、2 cm-1 の解像度で波長範囲 (400 ～ 4000 cm-1) にわたって収集されました。バックグラウンドスペクトルは、個々のサンプルの前に収集されました。

検体からSDS法により抽出したDNAを用いて配列決定を行い、アガロースゲル電気泳動によりDNAの純度および濃度を確認しました。 PCR 増幅には、Barcode を備えた特異的プライマー、GC バッファーを含む Phusion® High-Fidelity PCR Master Mix (New England Biolabs、England)、および高効率の High-Fidelity 酵素を使用しました 101。 16S rRNA 遺伝子はプライマーセット 515F/806R を使用して増幅されました。 DNA の完全性とおよその長さは 2% アガロースゲル電気泳動によって検査され、PCR 産物は PCR 精製キット (QIAGEN、ヒルデン、NRW、ドイツ) で精製されました 102,103。 PCR ライブラリーは、TruSeq® DNA PCR-Free 標本調製キット (Illumina、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して実施されました。 Qubit による定量化および Q-PCR 定量化の後、適格な PCR ライブラリーを Illumina NovaSeq6000 プラットフォームで配列決定しました。

バーコード配列と PCR 増幅プライマー配列に従ってバーコードとプライマー配列を切り詰めた後、FLASH (V1.2.7) を使用して各検体のリードをスプライスし、生のタグを取得しました 104。品質管理は生のタグで実行され（配列長は 200 ～ 10,000 塩基対、連続した同一塩基対 N < 6、ファジー塩基 N < 1、Q < 25）、その後、Fastp ソフトウェアを使用して、スプライスされた生のタグをフィルター処理しました。きれいなタグを取得します。キメラ配列を除去した後、微細な有効タグが得られた105。 OTU のその後の多様性指数と存在量情報分析では、Uparse アルゴリズム (Uparse v7.0.1001)106 を使用して、すべての標本のすべての有効なタグをクラスター化し、配列を 97% の配列類似性で OTU (操作分類単位) にクラスター化しました。 OTU 配列に対して種アノテーションを実行し、Mothur 法と SSUrRNA データベース (SILVA138.1) を使用して種アノテーション分析を実行して 107,108、各分類レベル (界、門、綱、目、科、属、種。

アルファ多様性指数 (α 多様性) は、標本内の微生物群集の多様性を示すために使用されました。 QIIME 計算と R ソフトウェアを使用して、シーケンスの深さをカバーしました109。 Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、および ACE 指数は QIIME ソフトウェア (バージョン 1.9.1) を使用して計算され、希釈曲線とランク存在量曲線は R ソフトウェア (バージョン 2.15.3) を使用して描画されました110。ベータ多様性指数 (β 多様性) を使用して、さまざまな標本の微生物群集の組成を分析しました。重み付けされた非 ifrac 距離に基づいて、OTU に基づく Bray-Curtis 距離は、非計量多次元尺度法 (NMDS) から導かれました 111,112。 UPGMA クラスター分析は、重み付けされた unifrac 距離行列と重み付けされていない unifrac 距離行列を使用して実行されました。クラスタリングの結果は統合され、各標本における門レベルでの種の相対存在量とともに表示されました 113,114。 PCA 分析を適用して、標本間の違いを最もよく反映する 2 つの軸を抽出しました111。 unifrac 距離は QIIME ソフトウェア (バージョン 1.9.1) によって計算され、UPGMA 標本クラスタリングツリーが構築されました。 PCA および NMDS プロットも R ソフトウェア (バージョン 2.15.3) を使用して描画されました。潜在的な機能遺伝子には、PICRUST 予測を使用して KEGG データベースに対して注釈が付けられました 115,116。識別分類群の系統図は、LEfSe ソフトウェア (V1.0) を使用して、Kruskal-Wallis に基づく線形判別分析 (LDA) によりログスコア > 3.5 および P = 0.05 でさび関連グループで同定されました 7,117。各分類法の相対存在量は、3 つの分類法の平均値でした。 T 検定は、異なる治療間の個々の機能遺伝子の違いを決定するために使用されました 7。

この研究の結果を裏付けるデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。得られた 15 標本の配列決定データは、Bioproject アクセッション番号 PRJNA865886、生物標本番号 SAMN 30139936 ～ 30139950 で NCBI Short Read Archive (SRA) データベースに保管されました。

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著者らは、この研究に対する財政的支援が、中国国家重点研究開発計画 (No. 2022YFB2603000)、中国山東省重点 R&D プログラム (No. 2022CXPT027)、および MIITC ハイテク船舶研究プロジェクトの支援であることを認めたいと思います。 (番号 MC-202003-Z01-02)。

海洋環境腐食と生物付着の主要研究室、中国科学院海洋研究所、青島、266071、中国

王正泉、王秀通、黄燕良、侯宝龍

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王正泉、王秀通、黄燕良

海洋メガサイエンスセンター、中国科学院、青島、266071、中国

王正泉、王秀通、黄燕良

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ZW が論文を起草し、XW の監督の下で実験作業を実施しました。著者全員が結果を評価し、視覚化しました。 XW と YH が論文をレビューし、編集しました。

王秀通さんへの対応。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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受信日: 2023 年 1 月 19 日

受理日: 2023 年 5 月 12 日

公開日: 2023 年 5 月 24 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41529-023-00365-2

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