β 上で陽極成長させた TiO2 ナノワイヤの表面での骨芽細胞前駆細胞の増殖

Scientific Reports volume 12、記事番号: 7895 (2022) この記事を引用

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メトリクスの詳細

研究では、陽極成長した TiO2 ナノチューブ (TNT) が優れた生体適合性を示すことが示されています。しかし、TiO2 ナノワイヤ (TNW) はあまり注目されていません。この研究の目的は、Ti-35Nb-7Zr-5Ta (TNZT) 合金の電気化学的陽極酸化によって成長させた TNW の表面での骨芽細胞前駆細胞の増殖を調査することでした。 TNT および平らな TNZT 表面を対照サンプルとして使用しました。 MC3T3-E1 細胞をサンプルの表面で最大 5 日間培養し、蛍光顕微鏡、比色分析、および走査型電子顕微鏡を使用して細胞の生存率と増殖を調査しました。結果は、実験条件間での細胞生存に有意な差がなく、対照サンプルと比較して、TNW 表面での細胞増殖速度が低いことを示しました。接触角の測定により、TNW の親水性が良好なレベルであることが示されましたが、比較的細い直径と高密度が細胞増殖に影響を与えた可能性があります。生体適合性に影響を与えるすべてのパラメーターを理解するにはさらなる研究が必要ですが、これらの TiO2 ナノ構造は、とりわけ骨欠損の治療や骨組織の再生のための有望なツールとなる可能性があります。

チタンとその合金は、比強度（強度対重量比）が高く、金属の中で最高の生体適合性を持っています。チタンは自然に表面に酸化物 (TiO2) を形成し、水性媒体中でも効果的に腐食から保護します。したがって、チタンは製造コストが比較的高いにもかかわらず、特に航空宇宙産業 1 や生物医学産業 2 など、多くの用途に有利です。低温では、純チタンはα相として知られる六方最密結晶構造を持ち、882℃で同素体変態してβ相として知られる体心立方構造になります。低温でβ相を安定させるために、Mo、Nb、V、Taなどの合金元素をチタンに添加できます。チタン合金は、生体医用材料、特に硬組織の代替に使用される材料の製造に広く使用されています。チタンのβ相はかなり低い弾性率を示し、インプラントと骨の間の機械的適合性を高めます。応力遮蔽効果 3 を軽減するには、インプラントの弾性率を骨の弾性率にできるだけ近づける必要があります。これは、骨量の減少 (骨減少症) を引き起こし、最終的にはインプラントの失敗につながる可能性がある深刻な問題です。市販の純チタンやステンレス鋼などの一般的に使用される生体材料の弾性率は、骨の弾性率の最大 6 倍である可能性があります4。近年、Ti-Nb-Zr-Ta 四元系をベースとした β 型チタン合金が、優れた生体適合性と低い弾性率により、外科インプラントへの応用が研究されています 5。そのような材料の 1 つは Ti-35Nb-7Zr-5Ta (TNZT) で、有害な元素を含まない低い弾性率 (約 60 GPa6,7) を持つ準安定 β チタン合金です。もう 1 つの重要な関心事は、インプラントのオッセオインテグレーション、つまり骨との安定した固定を形成する能力です。インプラントが人体に挿入されると、炎症反応が発生し、コラーゲン分子によるインプラントのカプセル化で炎症反応が終わります。このカプセル形成を避けることは困難ですが、チタンベースの材料は、ステンレス鋼や Co-Cr 合金などの他の生体医用金属と比較して最小限のカプセル化しか示しません。

チタンは他の金属生体材料に比べて優れているにもかかわらず、オッセオインテグレーションを強化し、インプラント拒絶率を下げるにはさらなる進歩が必要です。インプラントの生体適合性はその表面化学とトポグラフィーに密接に関係しているため、電気化学的陽極酸化による TiO2 ナノチューブ (TNT) の成長 10 を含め、チタンの表面修飾が広く研究されています 8,9。後者には、フッ化物含有電解質によって分離されたチタンまたはチタン合金基板（アノード）と対電極（カソード）の間に電位を印加することが含まれる。陽極酸化中の TNT の形成は同時プロセスの組み合わせによるもので、これは TiO2 層の電場支援成長とチューブで優先的に起こるフッ化物含有電解質による TiO2 の化学的溶解との競合として要約できます。ベース11。 TNT の陽極成長中に、「竹割りモデル」として知られる TNT の垂直分割プロセスにより、TNT の上部に TiO2 ナノワイヤ (TNW) が形成されます 12。最終的なナノ構造は、TNT とその上部に TNW で構成され、TNW の長さは TNT よりもさらに長くなる場合があります。 TNW の形成に必要な陽極酸化パラメータは基板 (アノード) の組成によって異なる場合があり、TNZT 合金はその形成に有利です 13。 TNW は、エレクトロスピニング、レーザーアブレーション、酸化などの他の技術によっても合成できます 14。 TiO2 ナノファイバー (TNF) という用語は、TNW に類似した構造を説明するために文献でも使用されます。これら 2 つの用語の違いは明らかではありませんが、TNW の直径は通常数十ナノメートル程度であるのに対し、TNF の直径は最大 1 μm とそれよりも大きくなります15。 TNW と TNF は両方とも表面積が大きいため、細胞の付着と増殖に役立つ可能性があります。ポリマー繊維性足場の生体適合性に関する研究 16 では、このタイプの形態が天然の骨細胞外マトリックスとの類似性により、細胞にとって好ましい環境を提供することが示されています。さらに、陽極成長した TNW には、複雑な形状のインプラント上でも容易に成長できるという利点があり、基板から直接成長するため、インプラント表面に付着させるための追加の手順が必要ありません。

かなりの数の研究 17 が、TNT が細胞の付着と増殖を適切にサポートする有望な生物医学材料であることを示しています。しかし、TNW (または TNF) コーティングの生体適合性は文献ではほとんど注目されていません。どのような研究であっても、方法、デザイン、結果に多くの違いがあるため、比較するのは困難です18、19、20、21、22。これらの研究を表 1 にまとめます。さらに、これらの TiO2 ナノ構造の製造と応用に関するほとんどの研究では、最も伝統的で一般的に使用される合金である CP-Ti または Ti-6Al-4V が使用されています。一方、生物医学用途向けに設計されたTNZTなどの低弾性率β型チタン合金には、より注意を払う必要があります。 TNZT 合金は、骨との機械的適合性が強化されていることに加えて、TiO2 ナノ構造の陽極成長において CP-Ti よりも有利であり、3 倍長い TNT を生成し、TNW の形成がはるかに容易であることが示されています 13。私たちの知る限り、生物医学用のβ型チタン合金上で陽極成長させたTNWの表面における細胞の挙動を調査した研究はありません。したがって、この研究は、表面上で骨芽細胞前駆細胞を培養することにより、TNZT 合金上で陽極成長させた TNW の生体適合性を調査することを目的としました。 TNT でコーティングされた平らな TNZT 表面を対照サンプルとして使用しました。

Ti-35Nb-7Zr-5Ta (重量%) 合金は、Ar 雰囲気下で水冷銅るつぼ上で純粋な元素をボルタアーク溶解することによって製造されました。インゴットは少なくとも 10 回再溶解され、均質性を確保するために毎回の後にるつぼの上でひっくり返されました。続いて、Ar を充填した石英ガラス管にカプセル化し、1000 °C で 24 時間均質化して元素の微小偏析を除去しました。次に、インゴットを複数回冷間圧延して厚さを約 75% 減少させ、厚さ 2 mm のプレートを得ました。続いて、プレートを Ar 雰囲気下 800 °C (β トランザス温度以上) で 1 時間アニールし、その後水冷しました。

電気化学的陽極酸化による TNW の合成のために、TNZT 合金プレートを約 15 × 15 mm の小片に切断しました。サンプルの表面は、最大 1200 グリットの研磨紙でサンディングすることによって準備され、HF と HNO3 (1:1) で構成される酸性溶液中で 10 秒間化学的に研磨されました。陽極酸化は、容積約 100 ml（直径 50 mm、高さ 50 mm）の電解槽内で、陰極として 30 × 30 mm の白金メッシュを使用して実行されました。システムのアノードである TNZT サンプルは、セルの高さの半分に位置する直径 8 mm の円形窓を通して電解質溶液と接触しました。アノードとカソードは、連続電圧モードで動作する電源 (Elektro-Automatik 8200-70、Viersen、ドイツ) に接続されました。陽極酸化中、磁気撹拌子を使用して電解質を連続的に撹拌した。使用された陽極酸化パラメータは以前の研究に基づいています13。 TNW を成長させるには、エチレングリコールと 0.5 wt.% の NH4F および 10 vol.% の水を含む有機電解質を使用し、20 V の電圧を 12 時間印加しました。陽極酸化の直後に、サンプルを脱イオン水ですすいだ。

TNT コーティングされた平らな TNZT サンプルを対照表面として使用しました。 TNT と TNW は非常に異なる形態を示しますが、どちらも同様の陽極酸化プロセスで合成でき、どちらが得られるかは使用するパラメータのみに依存します。 TNT はすでに広範囲に研究されており、優れた生体適合性を示すことが知られているため、TNT サンプルが対照として選択されました 10。 TNT がより簡単かつ迅速に入手できることを考慮すると 13、陽極酸化 TNW を生体材料として使用することは、その生体適合性が優れている場合、または TNT よりも他の利点がある場合にのみ正当化されます。

ＴＮＴは、異なる陽極酸化パラメータが選択されたことを除いて、ＴＮＷの成長に使用されるのと同様の手順で合成された。有機電解液の代わりに、０．３体積％のＨＦを含む水性電解液を使用し、２０Ｖの電圧を１時間印加した。水性電解質は TiO2 層の厚さを制限し、TNW の形成を防ぎます 13。平らなサンプルは、TNZT プレートを研磨紙で 1200 グリットまで研磨し、HF と HNO3 (1:1) で構成される酸性溶液中で 10 秒間化学研磨することによって作成されました。

TNW、TNT、および平らな TNZT 表面の濡れ性は、ASTM D7334-08 規格 23 に記載されているガイドラインに従って、水滴とサンプル表面の間の接触角を測定することによって評価されました。接触角を測定する前に、3 つの異なる乾燥手順を使用しました: (i) N2 流による約 2 分間の乾燥、(ii) 真空下での乾燥、および (iii) 脱イオン水に 24 時間浸漬し、その後真空乾燥。垂直位置に固定されたマイクロピペットを使用して、5μlの脱イオン水をサンプル表面に静かに堆積させた。水滴の形状は、ポータブルデジタル顕微鏡カメラを使用して記録されました。水滴と表面の間の接触角は、ImageJ ソフトウェア 24 の接触角プラグインと各条件ごとに少なくとも 3 つのサンプルを使用して測定されました。

MC3T3-E1 骨芽細胞前駆細胞株は Sigma-Aldrich (ECACC、カタログ番号 99072810) から入手し、10% ウシ胎児血清 (Sigma-Aldrich) を補充したアルファミニマムエッセンシャル培地 (α-MEM; Pan Biotech) で維持しました。およびペニシリン/ストレプトマイシン (ドミニクダッチャー) を 37 °C、5% CO2 で培養し、培地を 2 日ごとに交換しました。細胞がコンフルエントになったら、細胞を剥がし、0.25% トリプシンを使用して継代しました (Dominique Dancher)。細胞培養の前に、すべてのサンプルをエタノール (70%) で 1 時間洗浄し、その後水洗し、紫外線 (UV) を 20 分間照射して滅菌しました。 TiO2 表面を UV に曝露すると、原理的には濡れ性が変化しますが、細胞培養中にサンプルが水性環境に浸漬されると、この変化は元に戻ります。生体適合性実験では、6000 個の細胞を含む完全な α-MEM 80 μl を平らな TNZT、TNT、および TNW 表面の上に置きました。３時間のインキュベーション後、３ｍｌの培地をサンプルを含むペトリ皿（３５ｍｍ）に添加した。

細胞増殖は、カルセインアセトキシメチルエステルの取り込みを 24 時間ごとに測定することによって推定されました。生細胞では、細胞内エステラーゼによるアセトキシメチルエステルの加水分解の後、非蛍光カルセインは緑色蛍光カルセインに変換されました。簡単に説明すると、細胞を3μMカルセインAM（Molecular Probes、Life Technologies）とともに37℃で30分間インキュベートし、その後HBSS（Gibco）で洗浄し、Nikon Eclipse 90i蛍光顕微鏡で視覚化しました。少なくとも 5 つのランダムに選択されたフィールドが、Nikon DXM 1200F カメラを使用して実験条件ごとにキャプチャされ、分析されました。カルセイン陽性細胞の数を推定するために、すべての画像の背景を事前に調整して、フィールドごとに総蛍光ピクセルをカウントしました。分析には ImageJ ソフトウェアバージョン 1.51j8 (米国メリーランド州国立衛生研究所) を使用しました。

MTT (3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロミド) アッセイでは、細胞を 0.5 mg/ml MTT 試薬 (Sigma-Aldrich) とともに 37 °C でインキュベートしました。 2時間後、2mlの2-プロパノールを各培養プレートに添加し、マイクロプレートリーダー(Thermo Multiskan Ex)を使用して560nmで吸光度を測定した。 MTT 測定は、細胞をプレーティングしてから 1、3、および 5 日後に実行されました。

結果は平均±SEMとして表され、データはGraphPad Prismソフトウェアバージョン7.04（GraphPad Software、サンディエゴ、カリフォルニア州、米国）を使用して分析されました。カルセイン陽性ピクセルと MTT 分析は、二元配置分散分析とそれに続くダネットの事後検定を使用してグループ間で経時的に比較されました。

細胞の形態は、加速電圧0.3〜30 kVのSEM（Hitachi S-3000N）によって観察されました。 SEM による特性評価の前に、細胞を TNW および対照サンプルの表面で 48 時間培養しました。続いて、細胞を固定、脱水、乾燥し、金でコーティングしました。固定プロセスは、カコジル酸緩衝液（pH 7.4）で 15 分間 4 回連続洗浄し、カコジル酸緩衝液中の 2% グルタルアルデヒドで 1 時間固定し、カコジル酸緩衝液中の 1% 四酸化オスミウムで 2.5 時間固定することから始まりました。蒸留水で 5 回洗浄した後、サンプルを 1% タンニンとともに暗所で 1 時間インキュベートして脱水しました。次に、サンプルをエタノールの濃度を増加させて (70%、80%、90%、96%、100%) それぞれ 10 分間脱水し、次の割合のヘキサメチルジシラザン (HMDS) の 3 つの溶液を使用して乾燥させました。 + 100% アルコール 2 部 (20 分); 等量の HMDS と 100% アルコール (20 分)。 HMDS 3 部 + 100% アルコール 1 部 (20 分)。最後に、スパッタメタライゼーション Q150T-S システム (Quorum Technologies) を使用して、3 つのサンプルを Au の薄層でコーティングしました。

X 線光電子分光法 (XPS) 分析は、単色放射線 Al Kα (1486.6 eV、100 μm、100 W、20 kV) を励起源として使用し、デュアル-ビームチャージ中和剤。高分解能スペクトルは、通過エネルギー 29.35 eV、X 線ビーム直径 100 mm で取得されました。 XPS スペクトルのインデックス付けには、NIST 標準参照データベース 25 が使用されました。Ｘ線回折（ＸＲＤ）分析（２ｑスキャン）は、Ｃｕ−ｋａ放射線（波長＝１．５４０６Å）を使用してＰａｎａｌｙｔｉｃａｌＸ'ＰｅｒｔＰｒｏ回折計を用いて実施した。

TNT および TNW の陽極成長用の基板として使用される TNZT 合金の XRD 分析を実行して、サンプルが予想どおりの相組成を持っているかどうかを確認しました。得られたパターンを図 1 に示します。図に見られるすべての反射は、この合金で予想されるように、チタンの体心立方晶 (β) 相からのものです (粉末回折ファイルデータベース - PDF 番号 01-071-9955)。

TNT および TNW の陽極成長の基板として使用される TNZT 合金の XRD 分析。観察された反射はすべて、チタンの体心立方晶 (β) 相からのものです。

有機電解質中でのTNZTサンプルの陽極酸化は20Vで12時間実行され、図2aに示すように、表面全体がTNWで密に覆われました。以前の研究でも観察されたように、TNW は非常に柔軟であるようで、クラスターにグループ化されていました 13。図2bで観察されるように、LimとChoi12が提案した竹割りモデルに従って、TNWはTNTの上に成長しました。 TNT は長さが約 4.6 μm、直径が 80 nm でした。図 2c は、TNW の高倍率画像を示しており、TNT 壁からの TNW の成長を示しています。 TNW の正確な長さは、形態が複雑に絡み合っているため測定が困難でしたが、長さは TNT と同じであるように見えました。ナノワイヤの平均直径は約２８ｎｍであった。

有機電解質中で 20 V で 12 時間陽極酸化された TNZT サンプルの FEG-SEM 顕微鏡写真。その結果、上部に TNW が形成されました。 (a) 上面図の画像、(b) 斜めから見た画像、(c) より高い倍率での上面図の画像。

TNT コーティングされたサンプルは、水性電解質を使用して 20 V で 1 時間 TNZT 合金を陽極酸化することによって得られました。薄い壁とよく開いた口を備えた、比較的均一な形態の TNT が生成されました (図 3a)。以前の研究で観察されたように、この陽極酸化条件下で形成されたナノチューブは、そのサイズに基づいて 2 つのグループに分類できます 13。最初のグループのナノチューブはより長くて幅が広く、平均長さは 1.65 μm、直径は約 109 nm でした。第 2 グループのナノチューブは第 1 グループのナノチューブを取り囲み (図 3b)、長さは約 1.1 μm、直径は 76 nm でした。 2 つのグループ間の長さの違いは、側面図の画像でよりよく視覚化されました (図 3c)。

水性電解質中で 20 V で 1 時間陽極酸化された TNZT サンプルの FEG-SEM 顕微鏡写真。 (a、b) 上面図と (c) 側面図の画像。

表 2 に、使用した陽極酸化パラメータとその結果の形態の概要を示します。

図 4 は、TNT および TNW サンプルの XPS 分析を示しています。調査（低解像度）スペクトル（図4a）は、予想どおり、Ti、Nb、Zr、Ta、およびO元素の存在を示しています。 Ti、Nb、Zr、Ta、および O の高分解能スペクトル（それぞれ図 4b ～ f）は、TiO2、Nb2O5、Ta2O5、および ZrO2 酸化物の存在を示しています（NIST 標準参照データベース 25）。両方のサンプルの結合エネルギー曲線は類似しています。表 3 は、XPS 分析から得られた元素組成の重量パーセントを示しています。 TNT と TNW の合成には異なる電解質と陽極酸化時間が使用されましたが、それらの化学組成は非常に類似しているため、生体適合性に影響を与えるとは予想されません。

TNT (水性電解液での陽極酸化) (青線) および TNW (有機電解液での陽極酸化) (赤線) の XPS 分析。 (a) (b) Ti 2p、(c) Nb 3d、(d) Zr 3d、(e) Ta 4f、(f) O 1s の完全な調査スペクトルと高分解能スペクトル。

MC3T3-E1 骨芽細胞前駆細胞株を、TNW および対照 (TNT およびフラット TNZT) サンプルの表面で培養しました。細胞の生存率と増殖を 5 日間、24 時間ごとに蛍光顕微鏡で評価しました。図 5 は、各サンプル表面および評価された各時点のカルセイン陽性細胞の代表的な画像を示しています。最初の分析により、細胞が 3 つの表面に接着し、増殖していることが明らかになりました。図が示すように、平坦な TNZT および TNT サンプルの表面で増殖した細胞は高い増殖率を示し、培養 5 日後には完全にコンフルエントになりました。しかし、TNW 表面上で増殖した細胞は増殖速度がかなり低く、平らな表面や TNT 表面よりも時間の経過とともに明らかに細胞数が減少しました。細胞増殖を定量化するために、実験条件全体で画像ごとの緑色ピクセルの数を数えることにより、顕微鏡画像の蛍光強度を推定しました（図6a）。結果は、フラットサンプルと TNT サンプルで同様の数の緑色ピクセルを示し、大きな違いはありませんでした。しかし、評価したすべての時点で TNW サンプルのピクセル数は大幅に低く、培養 5 日後の他の 2 つのサンプルのピクセル数よりも約 49% 低かった。さらに、細胞の生存率は、培養1、3、および5日後にMTTアッセイによって評価されました（図6b）。差は統計的に有意ではありませんでしたが、結果はピクセル計数法で得られたものと同じ一般的な傾向を示し、培養 5 日後に TNW サンプルの生細胞数が他の 2 つの表面に比べて少ないことを示しました。

化学的に研磨された材料、TNT、および TNW の表面上で培養 1 ～ 5 日目のカルセイン染色された MC3T3-E1 細胞の蛍光顕微鏡画像。

蛍光顕微鏡法 (a) および MTT アッセイ (b) によって評価した、TNW およびコントロールサンプル (平面 TNZT および TNT) の表面でのさまざまな時間の培養後の MC3T3-E1 細胞の増殖と生存率。値は、3 回の独立した実験の平均値 ± SEM を表します。 *P ≤ 0.05、**P ≤ 0.001 対フラット TNZT サンプル (二元配置分散分析、続いてダネットの事後検定)。

さまざまなサンプルの表面上の細胞の形態をより詳細に観察するために、48 時間の培養後に SEM を実行しました。図 7 は、TNW 表面および対照サンプル (平らな TNZT および TNT) 上の細胞の低倍率画像を示しています。蛍光顕微鏡画像と同様に、平らなサンプルとTNTサンプル（図7a、b）には高密度の細胞があり、表面をほぼ完全に覆っていました。対照的に、TNW サンプル (図 7c) では、細胞数が大幅に減少しました。図 8 は、平らな TNZT、TNT、および TNW サンプルの表面上の細胞の高倍率画像を示しています。 TNW サンプルに播種された細胞は、より細長い形態と糸状仮足を持っているようです。しかし、今後の免疫組織化学研究、つまりアクチン/ビンキュリンの研究は、さまざまな表面が細胞骨格の動態に与える影響を決定するのに役立つでしょう。さらに、SEM 画像では、細胞の接着や増殖に影響を与える可能性のある明らかな損傷なしで、TNW が表面に観察されます。

(a) 平らな TNZT、(b) TNT、および (c) TNW サンプルの表面で 48 時間培養した後の MC3T3-E1 細胞の走査型電子顕微鏡写真。

48 時間培養後の MC3T3-E1 細胞の走査型電子顕微鏡写真。 (a) フラット TNZT、(b) TNT、(c) TNW。

培養中の細胞増殖中に観察される違いを説明できる生体材料の重要な特性の 1 つは表面の湿潤性であり、これは生体適合性に影響を与える可能性があります。接触角測定は、濡れ性を評価する最も一般的な方法です。図9は、平坦なTNZT、TNT、およびTNWサンプルの接触角測定の結果を示しています（接触角が低いほど、濡れ性が高くなります）。平らなＴＮＺＴ表面およびＴＮＴ表面の接触角は、それぞれ約８６°および７５°であった。 TNW の濡れ性は陽極酸化後の乾燥方法に影響されました。陽極酸化された TNT を乾燥させる一般的な方法である N2 流による乾燥では、約 19° という比較的低い接触角が得られました。この研究で得られたTNWは長くて緻密であるため、乾燥がより困難である可能性があり、ナノ構造に閉じ込められている可能性のあるすべての水を除去するのにN2流が十分であるかどうかについて疑問が生じました。これを明確にするために、一部の TNW サンプルを真空下で 24 時間乾燥させたところ、約 63° という大幅に高い接触角が得られました。したがって、接触角測定前の真空乾燥ステップは、正しい測定のために不可欠でした。さらに、一部のサンプルは、骨芽細胞培養中にサンプルがさらされる水性環境をシミュレートするために、乾燥する前に 24 時間水に浸されました。この水浸漬は濡れ性に大きな影響を与えず、接触角は約 57°となりました。

平坦な TNZT、TNT、および TNW 表面の濡れ性 (接触角) の測定。 TNW サンプルの陽極酸化後の乾燥方法の影響を示します。

平坦な表面の濡れ性と比較して、TNT の濡れ性は毛細管効果により高いことが予想されました 10 が、濡れ性はナノチューブの形態や陽極酸化パラメータに応じて大幅に変化する可能性があります 10、26、27。現在まで、陽極TNWの濡れ性に関する研究は行われていないが、その高い表面粗さと浸透性は、その著しく高い濡れ性を説明できる可能性がある。生体材料の生体適合性に対する接触角の影響に関する Menzies と Jones のレビュー 28 では、疎水性の表面は生体適合性を低下させることが知られているが、親水性の高い表面も細胞間の相互作用を妨げるため有害である可能性があると結論付けています。 Lee et al.29 は、濡れ性勾配 (接触角は 30° から 90° まで変化) のある表面上の細胞の挙動を研究し、50° で細胞が最高の接着力を示すことを観察しました。最適な中間の接触角（低すぎず高すぎず）があるようです。 TNW 表面の湿潤性は良好な値を示しているように見えますが、おそらく他の要因がその生体適合性に大きく関連していると考えられます。

MC3T3-E1 細胞は、平らな TNZT サンプルと TNT サンプルの表面で同様の増殖を示し、両方の対照サンプルが良好な生体適合性を持っていることを示しました。 TNT 表面での高い増殖は他の研究のデータに基づいて予想され 17、TNT および平坦な Ti の表面での同様の細胞増殖も Chang ら 22 によって観察されています。はじめにでコメントしたように、TNW または TNF で覆われた表面上の骨細胞の活性を評価した研究はわずかです (表 1)。これらの研究の一部では、平面上と比較して TNW 表面上の細胞の増殖が増強されていることが示されていますが、表 1 にリストされている 6 つの研究のうち 4 つでは、増殖の減少または同様の増殖が観察されました。ナノ構造の寸法はこれらの研究間で大きく異なりました。

表面のトポグラフィーと形態は、TNW の生体適合性に影響を与えると予想されます。ナノワイヤー/ナノファイバーの直径と細孔サイズは、細胞の応答に影響を与えることが報告されています。 Badami ら 30 は、直径が約 140 nm から 2.1 μm の範囲のポリマー繊維上での MC3T3-E1 細胞の増殖と分化を研究し、繊維直径が小さいほど細胞密度が低くなり、繊維への細胞浸潤が妨げられることを観察しました。細胞が浸潤して骨基質タンパク質を生成するため、浸潤は骨形成にとって不可欠なパラメーターです16。エレクトロスピニング18、19、熱酸化20、および原子層堆積21によって得られたTNW/TNFの直径は、この研究または合成方法として電気化学的陽極酸化を使用した他の研究で得られたTNWの直径よりも大幅に大きかった。もう 1 つの重要な違いは、陽極成長させたナノワイヤはより高密度であり、実質的に細孔や自由空間が存在しないことです。

TNW と TNF はさまざまな方法で合成でき、その寸法と形態は使用する方法とパラメーターによって大きく異なります。これらのナノ構造の表面での骨芽細胞の増殖に関する研究の数はまだ非常に限られており、結果は決定的なものではありません。いくつかの研究では、生物医学用途への TNW/TNF の使用が有望であることを示していますが、細胞増殖に影響を与えるパラメーターについてはより深く理解する必要があります。さらに、TNZT 合金の電気化学的陽極酸化によって得られる長い TNW は非常に高い比表面積を提供し、触媒 31、バイオセンサー 32、薬物送達システム 33 などの他の潜在的な用途に有利となる可能性があります。

注意が必要な追加の安全上の懸念は、埋め込まれた TiO2 ナノ構造が損傷する可能性があることです。インプラントは頻繁に摩擦学的条件にさらされ、固形破片の放出を引き起こし、インプラント周囲の炎症反応を引き起こす可能性があります。「はじめに」で説明したように、陽極成長した TNW は陽極酸化中の TNT の垂直分割によって形成され、その結果、上部にナノワイヤを備えたナノチューブによって形成される二重形態が形成されます。このナノ構造は、基板からの破損や剥離から保護する必要があります。 TNT については、その機械的安定性に関するいくつかの研究が見られます。 Shivaram et al.34 によって有望な結果が発見され、TNT で覆われたチタンの体外移植が行われ、長さ 1 mm までの TNT に対して重大な損傷は観察されませんでした。 TNT コーティングのせん断強度は Cao らによって研究され 35、彼らは短い TNT ほど基板への接着力が高いことを観察しました。陽極TNWの機械的安定性に関する研究は文献に存在せず、この問題は将来的に取り組む必要がある。陽極 TNW の直径は、他の合成方法で製造された TNW の直径よりもかなり細く (表 2)、所定の半径に対する歪みが低いため、陽極 TNW に大きな柔軟性が与えられます (図 1 の形態に見られるように)。曲率。この柔軟性は、機械的損傷を回避するのに役立つ可能性があります。

この研究では、TNZT 合金上の電気化学的陽極酸化によって成長させた TNW の表面上の MC3T3-E1 骨芽細胞前駆細胞の生存率と増殖を評価しました。 TNT コーティングされた TNZT と平坦な TNZT を対照サンプルとして使用しました。 TNZT 合金は TNW の成長に適した基板であることが確認され、長い TiO2 ナノ構造の成長が可能になります。平らな TNZT 表面と TNT 表面での MC3T3-E1 細胞の増殖は同様で、比較的高かった。５日間の培養後のＴＮＷサンプル上の細胞増殖は、対照サンプル上の細胞増殖より少なくとも約２５％低かった。 TNW サンプル上の細胞の代謝活性が低いことが観察されたにもかかわらず、これらの差は統計的に有意ではなく、細胞の生存が 3 つの異なる実験条件間で同様であることを示しています。 TNW は中程度の親水性を示しましたが、対照サンプルの湿潤性はかなり高かったです。これは原則として、TNW 表面の生体適合性が強化されたことを示すはずです。ただし、表面トポグラフィーや TNW 形態など、他の要因がより重要な役割を果たしている可能性があります。 TNW および他の同様のナノ構造の表面での骨芽細胞の増殖に影響を与えるすべてのパラメーターを理解するには、さらなる研究が必要です。この研究で得られた長い TNW は、体積に対する表面積の比率が高く、他の用途にも役立ちます。

現在の研究中に生成および/または分析されたデータセットは、ZENODO リポジトリ https://doi.org/10.5281/zenodo.6345229 で入手できます。

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この研究は、ブラジルの研究助成機関 FAPESP (サンパウロ研究財団) [助成番号 2019/01760-5] の支援を受けました。 CALYPSOL-ATECWATER プロジェクトを通じてスペイン国立研究庁 (AEI) とスペイン科学・イノベーション・大学省 [助成金番号 RTI2018-097997-B-C33]。プログラム REMTAVARES [助成金番号 P2018/EMT-4341] を通じて Comunidad de Maddrid を支援します。

機械工学部、カンピナス大学 (ユニキャンプ)、Rua Mendeleyev、200、カンピナス、サンパウロ、13083-860、ブラジル

レオナルド・ファントン

キング・ファン・カルロス大学化学・環境技術学部、C/Tulip S/N、モストレス、28933、マドリッド、スペイン

レオナルド・ファントン、クリスティーナ・アダン、ラファエル・A・ガルシア＝ムニョス、ハビエル・マルガン

Research Support Laboratory, Fundación Alcorcón University Hospital, C/ Budapest 1, Alcorcón, 28922, マドリード, スペイン

フリーダ・ロリア、マリオ・アモーレス、M・ルース・パゾス

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LF は研究を設計し、実験作業の一部を実行し、主要な原稿を書きました。 FL、MA、MRP は生体適合性実験を実施して解釈し、結果について議論し、原稿の一部を執筆しました。 CA は研究を監督し、サンプルを準備し、結果を分析し、原稿の一部を書きました。 RAG は研究の概念化と結果の議論に参加しました。 JM は主な監督者であり、研究を設計し、結果を分析し、執筆プロセスに参加しました。著者全員が原稿をレビューしました。

ハビエル・マルガンへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Fanton, L.、Loria, F.、Amores, M. 他 β 型生体医用チタン合金上で陽極成長させた TiO2 ナノワイヤの表面での骨芽細胞前駆細胞の増殖。 Sci Rep 12、7895 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41598-022-11981-4

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受信日: 2022 年 3 月 5 日

受理日: 2022 年 5 月 4 日

公開日: 2022 年 5 月 12 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11981-4

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